描述：

Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫兰色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

组成与储存：

(1) BCA Reagent 100 ml，室温保存；(2) Cu Reagent 2 .5ml，室温保存；(3) BSA standard 4 mg/ml 1 ml，−20ºC冻存。1.5年有效。可进行500次微板(microplate)测定或100次1 ml比色杯测定。

所需设备：

比色计、酶标仪或微板比色仪，最佳工作波长562 nm，可在540-590 nm之间。

工作溶液(Working Reagent, WR)配制：

将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色；室温1周内稳定。

标准蛋白溶液配制：

用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20 µl 4000 µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H₂O/PBS/0.9%NaCl) = 50 µl (BSA=1600 µg/ml)，从中取25 µl连续倍比稀释，得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml，各25 µl。通常，样品蛋白浓度不会太高，也可以预先稀释待测样品，可以省略1600 µg/ml标准管而直接从800或1000 µg/ml开始，能节省标准蛋白用量。

蛋白浓度测定：

蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时，用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积1.1 ml，比色计测定。微板测定时，用96孔板，反应终体积225 µl，用酶标仪、微板比色仪测定。

1.      标准测定：将0.05~0.1 ml标准品或待测样本与1 ml WR工作溶液混合。

         微板测定：将25 µl标准品或待测样本与200 µl WR工作溶液混合。

2.      37ºC反应30min；也可25ºC室温2小时或过夜。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5-250µg/ml。

3.      将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。

4.      绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml)，Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。

表1  标准测定和微板测定方案的加样量和比例

注意事项：

1.      37ºC 30min或25ºC室温反应2小时对测量较为便利，但严格来讲此时反应尚未达到终点，通常每10 min OD562值升高约2.3%。然而，通常在10min内可以测定30管并不会明显影响测定精度。

2.      BCA法检测范围为20-2000 µg/ml。检测0.5~10 µg/ml高度稀释蛋白样品应采用Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5~250µg/ml。

3.      BCA法检测样品中含有脂类物质时光吸收值会偏高。样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10 mM不能使用BCA方法，葡萄糖浓度大于10 mM时可用改良Lowry法蛋白定量试剂盒 #P1512，EDTA大于10 mM的样品可用Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。另外，蛋白质样品经液体样品蛋白抽提试剂(#P1255)沉淀后，可彻底去除干扰BCA法、Bradford法、和Lowry法蛋白测定的物质。

4.      欲使测量能耐受下面表2所提示的最大干扰物质浓度，并保持测量精度，应在蛋白标准管中加入相应浓度的干扰物质，但会给操作带来不便。

5.      可测量吸附于固相支持物乳酶标板、琼脂糖、亲和层系凝胶上的蛋白。

6.      每次测定应该重新测定并制作标准曲线。